Dr. Ute Bahr, Goethe Universität Frankfurt, Institut für pharmazeutische Chemie

Die MALDI-TOF Massenspektrometrie ist eine einfache und schnelle Methode zur Qualitätskontrolle von synthetischen Oligonukleotiden, einschließlich ihrer chemischen Modifikationen wie z.B. Botin, Fluorescein u. Ä.

3-Hydroxypicolinsäure (unter Zusatz von Ammoniumcitrat) als Matrix liefert exzellente Spektren sowohl im positiven als auch negativen Ionenmodus.

1-5 pmol an Nukleotid werden mit der Matrix gemischt und zur Analyse gegeben. Die Genauigkeit der Massenbestimmung liegt mit externer Kalibrierung bei >0.03%, sie kann bei interner Kalibrierung bis auf etwa 50 ppm gesteigert werden. Durch Vergleich der gemessenen Masse mit dem berechneten Soll-Molekulargewicht kann man auf einfache Weise überprüfen, ob die Synthese des Oligonukleotids bzw. die Modifikation erfolgreich durchgeführt wurde oder ob Fehlsequenzen und evtl. Kettenabbrüche aufgetreten sind. Bis zu einer Länge von ca. 50 Basenpaaren können aufgrund der Massenauflösung von ca. 1000 Modifikationen und Verunreinigungen detektiert werden.

Voraussetzung für qualitativ hochwertige MALDI-Massenspektren ist eine gründliche Entsalzung der Proben, dabei zeigt sich MALDI durch das etablierte Präparationsprotokoll als wesentlich robuster, weniger störanfällig und schneller als die Elektrospray-Massenspektrometrie. Da die Tendenz, Kationen zu binden, mit zunehmender Länge des Oligonukleotids zunimmt, sind bei Oligonukleotiden über ca. 20 kDa (>65mer) Signalverbreiterungen durch Salz-Addukte zu beobachten, darüber hinaus treten wegen der zunehmenden Labilität der Verbindungen zunehmend Verluste von Basen auf. Trotz Einbußen in der Qualität der Massenspektren ist es aber bis ca. 30 kDa (100mer) möglich, dass Molekülionensignal intakter Nukleinsäuren eindeutig zu detektieren und seine Masse zu bestimmen.

_________________________
weiter

BioSpring Analytik

Analyse und Qualitätssicherung
MALDI-TOF MS
RNA Sequenzierung