Während der DNA-Synthese gibt es bei jedem neuen Synthesezyklus so genannte Abbrüche. Die Synthese erfolgt nie zu 100%, sondern z.B. nur zu 99%. Bei jedem weiteren Schritt erhöht sich die Anzahl der verkürzten und nicht verlängerten Oligonukleotidketten. Bei einem 10mer beispielsweise ist der vollständige Strang bei einer Syntheseeffizienz von 99% zu (99%)9 = 91% vorhanden. Bei einem 20mer wäre dies (99%)19 = 81%. Dies bedeutet, dass bei der Synthese
eines 20mers abhängig von dem Syntheseverlauf max. 81% Volllängenprodukt und 19% Abbruchsequenzen vorliegen. Verläuft eine Synthese z.B. aufgrund minderwertiger Chemikalien ineffizienter, z.B. nur mit einer Effizient von 98%,
dann erhält man bei einem 20mer am Ende nur 68% Volllängenprodukt und 32% verkürzte Sequenzen. Durch eine Reinigung lässt sich das Volllängenprodukt von den verkürzten Sequenzen abtrennen. Synthese langer Oligonukleotide und Reinigung Bei kurzen Oligonukleotiden ist der Anteil an verkürzten sog. n-1 Banden im Verhältnis gering. Daher wird bei einfachen Anwendungen auch keine HPLC-Reinigung benötigt, da die Synthese bei Verwendung von qualitativ hochwertigen Ausgangsmaterialien zu einem überwiegenden Anteil zum Volllängeprodukt führt. Bei vielen Anwendungen kann es aber doch zu starken Nebeneffekten oder zu verfälschten Ergebnissen führen, wenn die verkürzten Sequenzen eine Konkurrenzreaktion zu den verlängerten Sequenzen eingehen. Insbesondere quantitative Verfahren sind sehr sensibel gegenüber solchen Einflüssen. Hier kann daher eine RP-Fast-Reinigung oder eine FDC-HPLC sinnvoll sein. Je länger ein Oligonukleotid bei der Synthese wird, desto höher wird der Anteil an n-1 Abbruchsequenzen. Bei einem 90mer beispielsweise liegt bei einer Syntheseeffizienz von 99% das Volllängenprodukt max. nur noch zu 41% vor. Die anderen 59% sind verkürzte Sequenzen. Bei einer Syntheseeffizienz von 98% liegt das Volllängenprodukt theoretisch nur noch zu 16,6% vor. Bedingt durch die Länge verlaufen die Syntheseausbeuten im Verlauf einer Synthese aber mit immer schlechterer Effizienz. Daher kann man davon ausgehen, dass bei einem unaufgereinigten 90mer etwa nur noch 10-15% Volllängenprodukt ist. Bei einem 150mer liegt der Anteil des Volllängenproduktes unter 1%! Wenn dann auch noch minderwertige Chemikalien eingesetzt werden, geht der Anteil des Volllängenproduktes mit korrekter Sequenz noch weiter zurück. Außerdem muss berücksichtigt werden, dass aufgrund der Länge des Oligonukleotides Sekundärstrukturen und sterische Faktoren den Einsatz eines solch langen Oligonukleotides sehr erschweren. Daher sind für den Einsatz langer Oligonukleotide in der Forschung ein hoher Reinigungsgrad und qualitativ hochwertige Chemikalien unabdingbar. Aufgrund der Länge sind die Laufeigenschaften des Volllängenproduktes und der verkürzten Sequenzen sehr ähnlich. Daher muss das Reinigungsprogramm so konzipiert sein, dass 90-99,9% der Abbruchsequenzen vom Volllängenprodukt abgetrennt werden. Ist eine solche Reinigung nicht effizient, dann gelingt es lediglich die kurzen Fehlsequenzen abzutrennen, die langen Abbruchbanden bleiben nach wie vor erhalten. Der erfolgreiche Einsatz des Oligonukleotides ist dann nicht mehr möglich.
Abb. 1 | Reinigung von Standardoligonukleotiden. Je weiter oben im Diagramm eine Reinigungsart steht, desto effektiver werden n-1 Banden vom Hauptprodukt abgetrennt. Die Reinheit des Hauptproduktes ist auch abhängig von der Basenlänge eines Oligonukleotides. Je länger ein Oligonukleotid ist, desto schwieriger wird es, während einer Reinigung die verkürzten Stränge abzutrennen. Daher müssen mit zunehmender Sequenzlänge immer aufwendigere Reinigungsprotokolle durchgeführt werden. Die Reinigungsmethode sollte hauptsächlich auf die Länge und Applikation des Oligonukleotides abgestimmt sein. Für eine einfache PCR-Reaktion ist bei einer Länge von 10-45 Basen der OE-Standard ausreichend. Je nach Einsatzbereich kann aber auch schon bei einer Länge von 20 Basen die FDC-HPLC sinnvoll sein. _________________________ |
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